per Shahroud University of Medical Sciences مجله دانش و تندرستي در علوم پایه پزشکی 1735-577X 2345-3753 2023-06-13 9 19 2498 Shadi Setayeshi 0 https://orcid.org/0000-0003-3658-7694 Yousef Yahyapour 1 https://orcid.org/0000-0002-8823-8042 Hossein Ghorbani 2 https://orcid.org/0000-0002-8209-069X Fahimeh Nokhostin 3 https://orcid.org/0000-0002-2181-9010 Meghdad Bagheri 0 https://orcid.org/0000-0001-6930-6794 Farzin Sadeghi 4 https://orcid.org/0000-0001-8599-3643 - کارشناس ارشد بیوتکنولوژی پزشکی، گروه میکروب‌شناسی و بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی بابل، ایران. - استاد ویروس‌شناسی، مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی و گرمسیری، پژوهشکده سلامت، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی بابل، ایران. - استادیار آسیب‌شناسی، گروه آسیب‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی بابل، ایران. - استادیار زنان و زایمان، گروه گروه زنان و زایمان، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی شهید صدوقی یزد، ایران. - دانشیار ویروس‌شناسی، مرکز تحقیقات بیولوژی سلولی و مولکولی، پژوهشکده سلامت، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی بابل، ایران. مقدمه: افزایش بار ویروسی در زنان با عفونت مزمن ویروس پاپیلومای انسانی تیپ 16 (Human Papilloma Virus 16) و الحاق ژنوم ویروس در کروموزم سلولی با افزایش شیوع ضایعات پیش بدخیم/بدخیم در دهانه رحم مرتبط است. در این مطالعه مراحل راه‌اندازی پانل تشخیصی سنجش بار ویروسی و وضعیت فیزیکی ژنوم HPV16 بر روش Multiplex Real-Time PCR تشریح شده است. مواد و روش‌ها: در این پژوهش یک ناحیه محافظت شده از ژن‌های E6 و E2 ویروس HPV16 پس از استخراج از رده سلولی CaSki و تکثیر با روش PCR در پلاسمید باکتریایی pJET1.2/blunt cloning vector کلون شده و همراه با پلاسمید نوترکیب حاوی ناحیه محافظت شده از ژن سلولی RnaseP به‌عنوان استاندارد جهت سنجش کمی میزان بار ویروسی به‌صورت کپی در هر سلول و در نهایت تعیین وضعیت فیزیکی ژنوم ویروس با روش Multiplex Real-Time PCR مورد استفاده قرار گرفت. نتايج: در نتایج Real Time PCR شاخص‌های اختصاصیت، ضریب R2، شیب و کارایی در محدوده معیارهای پذیرش قرار داشته که نشان می‌دهد ژن‌های E2 و E6 ویروس HPV16 و ژن سلولی RnaseP با خطی بودن خوب شناسایی می‌شوند. نتایج نسبت E2/E6 در سلول‌های CaSki در مطالعه حاضر (E2/E6 ratio=0.15) بیانگر حضور ترکیبی از ژنوم‌های اپیزومال و الحاق شده (Mixed) در این رده سلولی بود. نتیجه‌گیری: نتایج به‌دست آمده در این مطالعه نشان می‌دهد پانل تشخیصی طراحی شده برای سنجش بار ویروسی و وضعیت فیزیکی ژنوم HPV16 بر روش Multiplex Real-Time PCR از خطی بودن، حساسیت و اختصاصیت مناسبی مطابق معیارهای پذیرش از پیش تعیین شده برخوردار بود. Introduction: Higher viral load in women with chronic Human Papillomavirus type 16 (HPV 16) infection and integration of the viral genome into the cell's chromosomes associates with an increased prevalence of premalignant/malignant lesions in the cervix. The present study describes the development of simultaneous measurement of viral load and physical status for the HPV16 genome by the Multiplex Real-Time PCR method. Methods: In this study, conserved genes (E6 and E2) of HPV16 were extracted from the CaSki cell line and, after PCR amplification, cloned in bacterial plasmid pJET1.2/blunt cloning vector. In addition, recombinant cellular RnaseP gene plasmid was used as an internal amplification control gene. Results: Based on our findings, the E2 and E6 genes of the HPV16 virus and the cellular RnaseP gene are identified with high efficiency. Besides, the results of the Real-time PCR showed a high R2 coefficient that reflects the linearity of the standard curve. The results of the E2/E6 ratio of CaSki cells (E2/E6 ratio=0.15) indicated the presence of both integrated and episomal forms in this cell line. Conclusion: According to the pre-determined acceptance criteria, the diagnostic panel designed to measure the viral load and the physical status of the HPV16 genome using the Multiplex Real-Time PCR method has appropriate sensitivity and specificity. https://knh.shmu.ac.ir/index.php/site/article/view/3048 ویروس پاپیلومای انسانی تیپ 16، بار ویروسی، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی، کلونینگ مولکولی.