بهينه‌سازي روش فنول کلروفرم سيليکا براي استخراج DNA از نمونه استخوان‌هاي قديمي
DOI::
https://doi.org/10.22100/jkh.v9i2.350کلمات کلیدی:
واکنش PCR، پلی‌مورفیسم STR، روش استخراج فنل کلروفرم سيليکا.چکیده
مقدمه: استخراج DNA از نمونه استخوان‌هاي قديمي همواره با مشکلات زيادی همراه است. روش فنول کلروفرم سيليکا یکی از روش‌هائی است که به‌طور معمول برای این منظور استفاده مي‌شود. در اين مطالعه هدف بررسي و بهينه‌سازي مراحل این روش است.
مواد و روش‌ها: DNA 62 نمونه استخوان (داراي عمر 3 تا 11 سال) ابتدا با روش فنول کلروفرم معمولي و سپس با تغيير بعضي پارامترها استخراج شد. DNA حاصل در هشت منطقه STR به نام‌هاي CD4, vWA, LPL, D5S818, D16S539, D13S317, F13, FES توسط واکنش PCR تکثير شد و نتايج حاصل برروي ژل اکريلاميد مقايسه شد.
نتایج: ميانگين بازدهي واکنش PCR، براي روش جديد و روش معمولی در هشت منطقه پلي‌مورفيک ذکر شده به‌ترتيب 75%، 78%، 81%، 76%، 85%، 71%، 89%، 86%و 64%، 39%، 70%، 49%، 68%، 76%، 71%،28% بود.متوسط ميزان DNA حاصل از روش بهينه شده (در غلظت µl35 ذرات سيليکا) و معمولي به‌ترتیب برابر µg/ml 5/267 با خلوص 12/1 و µg/ml 76/192 با خلوص 84/0 بود.
نتيجه‌گيري: طبق يافته‌هاي اين مطالعه به‌نظر مي‌رسد تيمار طولاني‌تر با EDTA يکي از عوامل مؤثر حذف بهتر کلسيم باشد و همچنين غلظت مناسب ذرات محلول سيليکا مي‌تواند تأثير مهمي در حذف مهار‌کننده‌هاي PCR داشته باشد.
مراجع
Davoren J, Vanek D, Konjhodzic R, Crews J, Huffine E, Parsons TJ. Highly effective DNA extraction method for nuclear short tandem repeat testing of skeletal remains from mass graves. Croat Med J 2007;48(4):478-85.
Parsons Tj, Huel R, Davoren J, Katzmarzyk C, Milos A, Selmanovic A, et al. Application of novel “mini-amplicon” STR multiplexes to high volume casework on degraded skeletal remains. Forensic Science International 2007;1:175-179.
Holland MM, Cave CA, Holland CA, Bille TW. Development of a quality, high throughput DNA analysis procedure for skeletal samples to assist with the identification of victims from the world trade center attacks. Croat Med J 2003;44(3):246-72.
Hochmeister MN, Budowle B, Borer UV, Eggmann V, Comey CT, Drinhofer R. Typing of deoxyribonucleic acid (DNA) extracted from compact bone from human remains. Journal of Forensic Sciences 1991;36(6):1649-1661.
Pancorbo MM, Castro A, Alonso S, Fernandez I, Barbero C, Garcia-Orad A, et al. Genetic typing with HUMTHO1, HUMvWA31A and HUMFES/FPS short tandem repeat loci, D1S80 variable number tandem repeat locus and HLA-PQα of recent and from XII-XIII centuries spongy bone. Elecrophoresis 1995;16:1612-1616.
Hänni C, Brousseau T, Laudet V, Stehelin D. Isopropanol precipitation removes PCR inhibitors from ancient bone extracts. Nucleic Acids Research 1995;23(5):881-882.
Anzai T, Naruse TK, Tokunaga K, Honma T, Baba H, Akazawa T, et al. HLA genotyping of 5000-and 6000-year-old ancient bones in Japan. Tissue Antigens 1999;54:53-58.
Yoder AD. Ancient DNA in subfossil lemurs: methodological challenges and their solutions. In: Rakotosamimanana E. New directions in Lemur studies. New York: Kluwer Academic/Plenum pub;1999.
Schmerer WM, Hummel S, Hermann B. Optimized DNA extraction to improve reproducibility of short tandem repeat gonotyping with highly degraded DNA as target. Electrophoresis 1999;20:1712-1716.
Cattaneo C, Craig OE, James NT, Sokol RJ. Comparison of three DNA extraction methods on bone and blood stains up to 43 years old and amplification at three different gene sequences. J Forensic Sci 1997;42:1126-1135.
Höss M, Paabo S. DNA extraction from pleistocene bones by a silica-based purification method. Nucleic Acids Res 1993;21:3913-3914.
Baron H, Hummel S, Herrmann B. Mycobacterium tuberculosis complex DNA in ancient human bones. J Archaeol Sci 1996;23:667-671.
Hummel S. Ancient DNA typing. Berlin: Springer 2003;57-80.
Hoss M, Paabo S. DNA extraction from pleistocene bones by a silica-based purification method. Nucleic Acids Res 1993;21(16):3913-3914.
چاپ شده
شماره
نوع مقاله
مجوز
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.
