مهار موقت بیان ژن VEGFR2 با استفاده از siRNA اختصاصی در محیط کشت

نویسندگان

  • Moslem Jafarisani1 1- دانشگاه علوم پزشکی شاهرود- دانشکده پزشکی- گروه علوم پایه- دانشجوی دکتری بیوشیمی بالینی
  • Masoomeh Masoomikarimi2 2- دانشگاه علوم پزشکی تربت حیدریه- دانشکده پزشکی- گروه علوم پایه- کارشناسی ارشد ایمونولوژی.
  • Ali Zarei Mahmudabadi3 3- دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌الله- مرکز تحقیقات آسیب‌های شیمیایی- گروه بیوشیمی- دکتری تخصصی بیوشیمی بالینی.
  • Majid Bahabadi4 4- دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌الله- مرکز تحقیقات آسیب‌های شیمیایی- گروه بیوشیمی- دکتری تخصصی بیوشیمی بالینی.

DOI::

https://doi.org/10.22100/jkh.v10i4.786

کلمات کلیدی:

VEGFR-2؛siRNA؛ نئوواسکولاریزاسیون؛ HUVEC؛ RT-PCR

چکیده

مقدمه: استفاده از siRNA برای خاموش‌سازی بیان ژن‌ها امروزه در حال گسترش است. از جمله اهداف این تکنولوژی؛ جلوگیری از بیان عامل رشد اندوتلیال عروقی است. مطالعه حاضر به‌منظور جلوگیری بیان گیرنده تیپ II این عامل (VEGFR-2: Vascular Endothelial Growth Factor Receptor II) با استفاده از siRNAی اختصاصی در محیط کشت صورت گرفته است.

مواد و روش‌ها: ابتدا با استفاده از توالی ژن هدف، توالی‌های siRNAی اختصاصی علیه آن طراحی؛ Blast و ساخته شد. از طرف دیگر cDNA سلول HUVEC سنتز و با کمک پرایمر اختصاصی و PCR به میزان موردنیاز تکثیر شد و سپس در وکتور بیانی PEFGP-N1 درج و تأيید شد. پلاسمید ناقل حاصله با استفاده از لیپوفکتامین به سلول Hela که فاقد بیان ژن هدف بود انتقال داده شد. میزان بیان  GFPدر وکتور اولیه و وکتور تراریخت شده در حضور و عدم حضور siRNA اختصاصی مورد ارزیابی قرار گرفت و میزان مهار ژن از طریق ارزیابی کاهش فلورسانس سبز رنگ ناشی از GFP و RT-PCR مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج: نتایج حاصل از دو siRNA به‌کار رفته بیانگر کاهش بیان ژن به‌ترتیب 56% و 62% در مقایسه با گروه کنترل بود (05/0P<).

نتیجه‌گیری: siRNAی اختصاصی طراحی شده علیه VEGFR-2 با استفاده از لیپوفکتامین به‌طور مناسب به‌داخل سلول منتقل و از بیان گیرنده به‌طور معنی‌دار جلوگیری نمود. در واقع با قطع مسیر پیام‌رسانی رگزایی، می‌تواند از پیدایش عروق جدید جلوگیری نماید لذا احتمالاً به‌عنوان یک عامل مناسب درمانی جدید در جلوگیری و یا کاهش رگزایی مطرح باشد.

مراجع

Kim B, Suvas S, Sarangi PP, Lee S, Reisfeld RA, Rouse BT. Vascular endothelial growth factor receptor 2-based dna immunization delays development of herpetic stromal keratitis by antiangiogenic effects. J Immunol 2006;177:4122-31.

Zheng M, Klinman DM, Gierynska M, Rouse BT. DNA containing CpG motifs induces angiogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:8944-9.

Millauer B, Wizigmann-Voos S, Schnurch H, Martinez R, Moller N, Werner R, et al. High affinity VEGF binding and developmentalexpression suggest Flk-1 as a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis. Cell 1993;72:835-46.

Galland F, Karamysheva A, Pebusque M, Borg J, Rottapel R, Dubreuil P, et al. The FLT4 gene encodes a transmembrane tyrosine kinase related to the vascular endothelial growth factor receptor. Oncogene 1993;8:1233-40.

Pajusola K, Aprelikova O, Korhonen J, Kaipainen A, Pertovaara L, Alitalo R, et al. FLT4 receptor tyrosine kinase contains seven immunoglobulin-like loops and is expressed in multiple human tissues and cell lines. Cancer Res 1992;52:5738-43.

Alitalo K., Carmeliet P. Molecular mechanisms of lymphangiogenesis in health and disease. Cancer Cell 2002;1:219-27.

Ambati BK, Nozaki M, Singh N, Takeda A, Jani PD, Suthar T, et al. Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1. Nature 2006;443:993-7.

Kim B, Tang Q, Biswas PS, Xu J, Schiffelers RM, Xie FY, et al. Inhibition of ocular angiogenesis by sirna targeting vascular endothelial growth factor pathway genes therapeutic strategy for herpetic stromal keratitis. American Journal of Pathology 2004;165:2177-85.

Zheng M, Deshpande S, Lee S, Ferrara N, Rouse BT: Contribution of vascular endothelial growth factor in the neovascularization process during the pathogenesis of herpetic stromal keratitis. J Virol 2001;75:9828-35.

Autiero M, Luttun A, Tjwa M, Carmeliet P. Placental growth factor and its receptor, vascular endothelial growth factor receptor-1: novel targets for stimulation of ischemic tissue revascularization and inhibition of angiogenic and inflammatory disorders. J Thromb Haemost 2003;1:1356-70.

van de Wetering M, Oving I, Muncan V, Pon Fong MT, Brantjes H, van leenen d, et al. Specific inhibition of gene experestion using a stably integrated, induceble small interfering RNA vector. EMBO Rep 2003;4:609-15.

Chi JT, Chang HY, Wang NN, Chang DS, Dunphy N, Brown PO. Genomewide view of gene silencing by small interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:6343-6.

Agrawal N, Dasaradhi PV, Mohmmed A, Malhotra P, Bhatnagar RK, Mukherjee SK.. RNA interference: Biology, mechanism and applications. Microbiol Mol Biol Rev 2003;67:657-85.

Jiang J, Xia XB, Xu HZ, Xiong Y, Song WT, Xiong SQ, et al. Inhibitory effect of interfering RNA targeting HIF-1alpha and VEGF on retinal neovascularization in the mouse. Retinal Disorder 2008;44:921-8.

Jiang J, Xia XB, Xu HZ, Xiong Y, Song WT, Xiong SQ, et al. Inhibition of retinal neovascularization by gene transfer of small interfering RNA targeting HIF-1alpha and VEGF. J Cell Physiol 2009;218:66-74.

Klinman DM, Zheng M, Gierynska M, Rouse BT. DNA containing bioactive CpG motifs promote angiogenesis. Drug News Perspect 2002;15:358-63.

Mei Zheng, Shilpa Deshpande, Sujin Lee, Napoleone Ferrara, Barry T. Rouse: contribution of vascular endothelial growth factor in the neovascularization process during the pathogenesis of herpetic stromal keratitis. Journal of Virology 2001;75:9828-35.

Forooghian F, Das B. Anti angiogenic effect of ribonucleic acid interference targeting vascular endothelial growth factor and hipoxia inducible factor alpha. Am J Ophthalmol 2007;144:761-8.

Kenyon BM, Voest EE, Chen CC, Flynn E, Folkman J, D’Amato RJ. A model of angiogenesis in the mouse cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996;37:1625-32.

Zheng M, Schwarz MA, Lee S, Kumaraguru U, Rouse BT. Control of stromal keratitis by inhibition of neovascularization. American Journal of Pathology 2001;159:1021-9.

Ferrara N, Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrinol Rew 1997;18:4-25.

Gerber H, Dixit V, Ferrara N. Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and A1 in vascular endothelial cells. J Biol Chem 1998;273:13313-6.

Gerber H, McMurtrey A, Kowalski J, Yan M, Keyt B, Dixit V, et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J Biol Chem 1998;273, 30366-43.

Benjamin LE, Golijanin D, Itin A, Pode D, Keshet E. Selective ablation of immature blood vessels in established human tumors follows vascular endothelial growth factor withdrawal. J Clin Invest 1999;103:159-65.

Leung D, Cachianes G, Kuang WJ, Goeddel D, Ferrara N. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science 1989;246:1306-9.

Nagy JA, Vasile E, Feng D, Sundberg C, Brown LF, Detmar MJ, et al. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor induces lymphangiogenesis as well as angiogenesis. J Exp Med 2002;196:1497-506.

De Vries C, Escopedo J, Ueno H, Houck H, Ferrara N, Williams L. The fms-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor. Science 1992;255:989-91.

Shibuya M, Yamaguchi S, Yamane A, Ikeda T, Tojo A, Matsushime H, et al. Nucleotide sequence and expression of a novel human receptor type tyrosine kinase gene (flt) closely related to the fms family. Oncogene 1990;5:519-24.

Terman B, Crrion M, Kovacs E, Rasmussen B, Eddy R, Shows T. Identification of a new endothelial cell growth factor receptor tyrosine kinase. Oncogene 1991;6:1677-83.

Matthews W, Jordan C, Gavin M, Jenkins N, Copeland N, Lemischka I. A receptor tyrosine kinase cDNA isolated from a population of enriched primitive hematopoietic cells and exhibiting close genetic linkage to c-kit. Proc Natl Acad Sci 1991;88:9026-30.

دانلود

چاپ شده

2015-09-28

شماره

نوع مقاله

مقاله پژوهشي

مقالات بیشتر خوانده شده از همین نویسنده