راه‌اندازی پانل تشخیصی سنجش بار ویروسی و وضعیت فیزیکی ژنوم ویروس پاپیلومای انسانی تیپ 16 به روش Multiplex Real-Time PCR

نویسندگان

  • شادی ستایشی - کارشناس ارشد بیوتکنولوژی پزشکی، گروه میکروب‌شناسی و بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی بابل، ایران. orcid https://orcid.org/0000-0003-3658-7694
  • یوسف یحیی پور - استاد ویروس‌شناسی، مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی و گرمسیری، پژوهشکده سلامت، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی بابل، ایران. orcid https://orcid.org/0000-0002-8823-8042
  • حسین قربانی - استادیار آسیب‌شناسی، گروه آسیب‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی بابل، ایران. orcid https://orcid.org/0000-0002-8209-069X
  • فهیمه نخستین - استادیار زنان و زایمان، گروه گروه زنان و زایمان، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی شهید صدوقی یزد، ایران. orcid https://orcid.org/0000-0002-2181-9010
  • مقداد باقری - کارشناس ارشد بیوتکنولوژی پزشکی، گروه میکروب‌شناسی و بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی بابل، ایران. orcid https://orcid.org/0000-0001-6930-6794
  • فرزین صادقی - دانشیار ویروس‌شناسی، مرکز تحقیقات بیولوژی سلولی و مولکولی، پژوهشکده سلامت، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی بابل، ایران. orcid https://orcid.org/0000-0001-8599-3643

DOI::

https://doi.org/10.22100/jkh.v18i2.3048

کلمات کلیدی:

ویروس پاپیلومای انسانی تیپ 16، بار ویروسی، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی، کلونینگ مولکولی.

چکیده

مقدمه: افزایش بار ویروسی در زنان با عفونت مزمن ویروس پاپیلومای انسانی تیپ 16 (Human Papilloma Virus 16) و الحاق ژنوم ویروس در کروموزم سلولی با افزایش شیوع ضایعات پیش بدخیم/بدخیم در دهانه رحم مرتبط است. در این مطالعه مراحل راه‌اندازی پانل تشخیصی سنجش بار ویروسی و وضعیت فیزیکی ژنوم HPV16 بر روش Multiplex Real-Time PCR تشریح شده است.

مواد و روش‌ها: در این پژوهش یک ناحیه محافظت شده از ژنهای E6 و E2 ویروس HPV16 پس از استخراج از رده سلولی CaSki و تکثیر با روش PCR در پلاسمید باکتریایی pJET1.2/blunt cloning vector کلون شده و همراه با پلاسمید نوترکیب حاوی ناحیه محافظت شده از ژن سلولی RnaseP بهعنوان استاندارد جهت سنجش کمی میزان بار ویروسی بهصورت کپی در هر سلول و در نهایت تعیین وضعیت فیزیکی ژنوم ویروس با روش Multiplex Real-Time PCR مورد استفاده قرار گرفت.

نتايج: در نتایج Real Time PCR شاخصهای اختصاصیت، ضریب R2، شیب و کارایی در محدوده معیارهای پذیرش قرار داشته که نشان می‌دهد ژن‌های E2 و E6 ویروس HPV16 و ژن سلولی RnaseP با خطی بودن خوب شناسایی میشوند. نتایج نسبت E2/E6 در سلولهای CaSki در مطالعه حاضر (E2/E6 ratio=0.15) بیانگر حضور ترکیبی از ژنوم‌های اپیزومال و الحاق شده (Mixed) در این رده سلولی بود.

نتیجه‌گیری: نتایج به‌دست آمده در این مطالعه نشان می‌دهد پانل تشخیصی طراحی شده برای سنجش بار ویروسی و وضعیت فیزیکی ژنوم HPV16 بر روش Multiplex Real-Time PCR از خطی بودن، حساسیت و اختصاصیت مناسبی مطابق معیارهای پذیرش از پیش تعیین شده برخوردار بود.

مراجع

Lee SJ, Yang A, Wu TC, Hung CF. Immunotherapy for human papillomavirus-associated disease and cervical cancer: review of clinical and translational research. J Gynecol Oncol 2016;27:e51. doi: 10.3802/jgo.2016.27.e51

Bergmans HE, van Die IM, Hoekstra WP. Transformation in Escherichia coli: stages in the process. J Bacteriol 1981;146:564-70. doi: 10.1128/jb.146.2.564-570.1981

Lefevre J, Hankins C, Pourreaux K, Voyer H, Coutlée F. Real-time PCR assays using internal controls for quantitation of HPV-16 and β-globin DNA in cervicovaginal lavages. J Virol Methods 2003;114:135-44. doi: 10.1016/j.jviromet.2003.09.003

Ho L, Chan SY, Chow V, Chong T, Tay SK, Villa LL, et al. Sequence variants of human papillomavirus type 16 in clinical samples permit verification and extension of epidemiological studies and construction of a phylogenetic tree. J Clin Microbiol 1991;29:1765-72. doi: 10.1128/jcm.29.9.1765-1772.1991

Yamada T, Manos MM, Peto J, Greer CE, Munoz N, Bosch FX, et al. Human papillomavirus type 16 sequence variation in cervical cancers: a worldwide perspective. J Virol 1997;71:2463-72. doi: 10.1128/jvi.71.3.2463-2472.1997

Chang L, He X, Yu G, Wu Y. Effectiveness of HPV 16 viral load and the E2/E6 ratio for the prediction of cervical cancer risk among Chinese women. J Med Virol 2013;85:646-54. doi: 10.1002/jmv.23490

Lefevre J, Hankins C, Money D, Rachlis A, Pourreaux K, Coutlée F. Human Papillomavirus Type 16 Viral Load Is Higher in Human Immunodeficiency Virus-Seropositive Women with High-Grade Squamous Intraepithelial Lesions Than in Those with Normal Cytology Smears. J Clin Microbiol 2004;42:2212-5. doi: 10.1128/JCM.42.5.2212-2215.2004

Peitsaro P, Johansson B, Syrjänen S. Integrated Human Papillomavirus Type 16 Is Frequently Found in Cervical Cancer Precursors as Demonstrated by a Novel Quantitative Real-Time PCR Technique. J Clin Microbiol 2002;40:886-91. doi: 10.1128/JCM.40.3.886-891.2002

Cricca M, Morselli-Labate AM, Venturoli S, Ambretti S, Gentilomi GA, Gallinella G, et al. Viral DNA load, physical status and E2/E6 ratio as markers to grade HPV16 positive women for high-grade cervical lesions. Gynecologic Oncology 2007;106:5.57-49 doi: 10.1016/j.ygyno.2007.05.004

Saunier M, Monnier-Benoit S, Mauny F, Dalstein V, Briolat J, Riethmuller D, et al. Analysis of Human Papillomavirus Type 16 (HPV16) DNA Load and Physical State for Identification of HPV16-Infected Women with High-Grade Lesions or Cervical Carcinoma. J Clin Microbiol 2008;46:3678-85. doi: 10.1128/JCM.01212-08

Khanal S, Shumway BS, Zahin M, Redman RA, Strickley JD, Trainor PJ, et al. Viral DNA integration and methylation of human papillomavirus type 16 in high-grade oral epithelial dysplasia and head and neck squamous cell carcinoma. Oncotarget 2018;9. doi: 10.18632/oncotarget.25754

Meissner JD. Nucleotide sequences and further characterization of human papillomavirus DNA present in the CaSki, SiHa and HeLa cervical carcinoma cell lines. J Gen Virol 1999;80:1725-33. doi: 10.1099/0022-1317-80-7-1725

Momenimovahed Z, Salehiniya H. Cervical cancer in Iran: integrative insights of epidemiological analysis. Biomedicine (Taipei) 2018;8:18. doi: 10.1051/bmdcn/2018080318

Burd EM. Human Papillomavirus and Cervical Cancer.Clin Microbiol Rev 2003;16:1-17. doi: 10.1128/CMR.16.1.1-17.2003

Yang X, Cheng Y, Li C. The role of TLRs in cervical cancer with HPV infection: a review. Signal Transduct Target Ther 2017;2:17055. doi: 10.1038/sigtrans.2017.55

Szymonowicz KA, Chen J. Biological and clinical aspects of HPV-related cancers. Cancer Biol Med 2020;17:864-78. doi: 10.20892/j.issn.2095-3941.2020.0370

Ye H, Song T, Zeng X, Li L, Hou M, Xi M. Association between genital mycoplasmas infection and human papillomavirus infection, abnormal cervical cytopathology, and cervical cancer: a systematic review and meta-analysis. Arch Gynecol Obstet 2018;297:1377-87. doi: 10.1007/s00404-018-4733-5

Liu C, Mann D, Sinha UK, Kokot NC. The molecular mechanisms of increased radiosensitivity of HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC): an extensive review. J Otolaryngol 2018;47:59. doi: 10.1186/s40463-018-0302-y

Peitsaro P, Johansson B, Syrjänen SJJocm. Integrated human papillomavirus type 16 is frequently found in cervical cancer precursors as demonstrated by a novel quantitative real-time PCR technique. J Clin Microbiol 2002;40:886-91. doi: 10.1128/JCM.40.3.886-891.2002

Cricca M M-LA, Venturoli S, Ambretti S, Gentilomi GA, Gallinella G, et al. Viral DNA load, physical status and E2/E6 ratioas markers to grade HPV16 positive women for high-grade cervical lesions. Gynecol Oncol 2007;106:549-57. doi: 10.1016/j.ygyno.2007.05.004

Oyervides-Muñoz MA, Pérez-Maya AA, Rodríguez-Gutiérrez HF, Gómez-Macias GS, Fajardo-Ramírez OR, Treviño V, et al. Understanding the HPV integration and its progression to cervical cancer. Infect Genet Evol 2018;61:134-44. doi: 10.1016/j.meegid.2018.03.003

Williams VM, Filippova M, Soto U, Duerksen-Hughes PJ. HPV-DNA integration and carcinogenesis: putative roles for inflammation and oxidative stress. Future Virol 2011;6:45-57. doi: 10.2217/fvl.10.73

Álvarez-Paredes L, Santibañez M, Galiana A, Rodríguez Díaz JC, Parás-Bravo P, Andrada-Becerra ME, et al. Association of Human Papillomavirus Genotype 16 Viral Variant and Viral Load with Cervical High-grade Intraepithelial Lesions. Cancer Prev Res (Phila) 2019;12:547-56. doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-18-0397

Tran SL, Puhar A, Ngo-Camus M, Ramarao N. Trypan blue dye enters viable cells incubated with the pore-forming toxin HlyII of Bacillus cereus. PLoS One 2011;6:e22876. doi: 10.1371/journal.pone.0022876

Lorenz TC. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp 2012:e3998. doi: 10.3791/3998

فایل‌های دیگر

چاپ شده

2023-11-26

شماره

نوع مقاله

مقاله پژوهشي

مقالات بیشتر خوانده شده از همین نویسنده

<< < 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 > >>